天然蛋白A（Protein A）是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白，天然蛋白G（Protein G）是一种分离于链球菌属的细胞表面蛋白，二者功能相似，主要与免疫球蛋白（IgG）的Fc区相互作用，可结合大多数哺乳动物的IgG。Protein A/G Agarose Beads是Protein A和Protein G与琼脂糖珠共价偶联而成，可用于免疫沉淀（IP）或免疫共沉淀（CoIP）来进行蛋白功能相关研究，或者直接装在层析柱上来纯化单克隆或者多克隆抗体。

储存条件

可在4℃保存一年，-20℃保存两年。冰袋运输。

注意事项

1. 为了您的健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。本产品仅作科研用途。

2. 若长期不用，建议将本品置于-20℃保存。请避免离心，干燥和反复冻融。

3. 本产品的储存缓冲液为PBS（含20％乙醇和0.03% NaN₃）。

实验流程

1. 收集细胞：

1）贴壁细胞：取10 cm细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤2次，然后加入1 mL细胞裂解液裂解细胞（如普通 IP裂解液或弱的RIPA裂解液，使用前加入蛋白酶抑制剂cocktail）。

2）悬浮细胞：离心收集细胞后，PBS洗涤1次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。

3）动植物组织样本：参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解，植物组织还需要先进行液氮研磨再裂解。

注意：不同量的细胞，应选用适当裂解液的用量进行裂解（如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在裂解过程中宜适当减少裂解液的用量），通常裂解液的总蛋白浓度选择在1.0 ~ 2.0 mg/mL范围内较合适，如果目的蛋白浓度偏低，也可以增加总蛋白用量。

2. 除非特应性结合（可选）：

1）取0.5 ~ 1 mL细胞或组织裂解液，蛋白量约为1.0 ~ 2.0 mg，加入约1 µg与免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20 µL充分重悬的Protein A/G Agarose Beads，4℃旋转混合1 ~ 2 h。

2）2500 rpm（约1000 g）离心5 min，取上清用于后续的免疫沉淀实验。

注意：种属相同的IgG是指与后续免疫沉淀所用一抗宿主相同的正常IgG，此步骤可以预先去除样本中与Protein A/G Agarose Beads非特异性结合的蛋白，从而降低背景。

3-1. 免疫沉淀（IP）操作流程：

1）抗体吸附

① 吹吸或颠倒混匀Protein A/G Agarose Beads的悬浊液，每个样品取20 µL加到1.5 mL离心管中，加入0.5-1.0 mL结合缓冲液（也可用细胞裂解液或者 PBS）重悬，1000 rpm离心1 min，吸弃上清。

② 向上述已平衡的Beads中加入0.5-1.0 mL结合缓冲液，并加入1-5 µg正常的IgG或目的蛋白的抗体，在4度条件下，于旋转混合仪混匀结合1 ~ 2 h后，1000 rpm离心1 min，收集Beads备用，最后剩余少许Buffer以防止Beads干掉。

2）抗体交联（可选，如需将抗体和目标抗原复合物共同洗脱，请忽略此步骤。）

① 向清洗过的Beads中加入1 mL交联Buffer，1000 rpm离心1 min，吸弃上清。

② 再向其中加入1 mL含有20 mM DMP（该试剂需现配现用）的交联Buffer，重悬Beads，室温下颠倒混匀或置于旋转混合仪轻轻翻转，促使Buffer和Beads充分接触，30 min后，1000 rpm离心1 min，吸弃上清。

③ 再向其中加入1 mL终止液，重悬Beads，终止交联反应，室温下手动颠倒混匀或置于旋转混合仪轻轻翻转15 min，1000 rpm离心1 min，吸弃上清。

④ 加入0.5 mL洗杂缓冲液，重悬Beads，进行清洗，1000 rpm离心1 min，吸弃上清，并重复2次，最后剩余少许Buffer防止 Beads干掉。

3）免疫沉淀反应

① 抗原结合：向上述已经结合好抗体的Beads中加入含抗原的样品（含目的蛋白的细胞或者组织裂解液），用移液器轻轻吹打或者颠倒混匀使Beads在细胞裂解液中分散均匀，然后在4℃条件下，置于旋转混合仪上轻轻翻转1-2 h，使抗原与抗体充分结合，如果结合力较弱，则可结合过夜。

② 洗杂：将上述完成抗原结合的产物1000 rpm离心1 min，收集上清液置于冰上待检测（也可直接舍弃不检测）。向离心管中加入1 mL洗杂缓冲液（也可直接用细胞裂解液洗杂），与Beads混匀后，在4度旋转混合仪上洗5-10分钟，1000 rpm离心1 min，弃上清，并重复洗涤2次，最后一次尽量吸干净Buffer。

3-2. 免疫共沉淀（coIP）操作流程：

1）抗原和抗体的结合：将IgG或者抗体分别与含有目的蛋白的细胞或者组织裂解液混合，4℃孵育至少2 h，或者4℃孵育过夜。

注意：孵育时间取决于目的蛋白与抗体的结合效率以及目的蛋白的稳定性，需根据具体情况进行优化；抗体的加入量需参考后续加入凝胶（Beads）的量，一般推荐加入1-5 µg IgG或目的蛋白抗体。

2）凝胶准备：取20 µl Protein A/G Agarose Beads加入到1.5 mL离心管中，加入0.5 ~ 1.0 mL结合缓冲液（也可用细胞裂解液或者PBS）重悬，1000 rpm离心1 min，吸弃上清。

3）抗原-抗体混合物的吸附：将含有抗原-抗体复合物的裂解液加入到已平衡的凝胶中，在4℃条件下，置于旋转混合仪轻轻翻转1 ~ 2 h，使其充分接触并吸附，1000 rpm离心1 min，收集上清留待检测（也可直接舍弃不检测）。

4）洗杂：向离心管中加入1 mL洗杂缓冲液（也可直接用细胞裂解液洗杂），与Beads混匀后，在4度旋转混合仪上洗5-10分钟，1000 rpm离心1 min，弃上清，并重复洗涤2次，最后一次尽量吸干净Buffer。

4. 样品洗脱：

1）变性洗脱：该方法适于SDS-PAGE检测。向上述离心管中加入20-40 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer混匀，95℃加热5 min。1000 rpm离心1 min，收集上清进行后续WB分析。

2）非变性洗脱：该方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后续功能分析。

具体做法：向上述免疫沉淀反应得到的凝胶-抗体-抗原复合物中加入5倍体积的洗脱Buffer，用移液器轻轻吹打数次，室温下手动轻弹混匀或置于旋转混合仪轻轻翻转10 min，1000 rpm离心1 min，吸取上清，收集洗脱组分，即为目标蛋白复合物，将其收集至新的离心管中，立即加入1/10体积的中和液，将pH调至7.0 ~ 8.0，备用。

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