- 产品参数
- 产品货号： HNB001
- 产品规格： 500 μL / 1 mL
- 品牌： belongbio
产品信息
产品概述
HA Nanobody Magnetic Beads是由anti-HA-tag（YPYDVPDYA）纳米抗体和磁性琼脂糖珠偶联而成，可以结合HA tag的融合蛋白。 本产品没有普通抗体的轻链和重链，解离常数达到nM-pM级别，20 μL珠子悬液可以结合10 ~ 15μg HA tag的融合蛋白，具有特异性强、背景干净、高亲和力、高载量、使用便捷等特点，可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）/RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性测定、质谱分析等实验。
储存条件
可在4℃保存一年，-20℃保存两年。冰袋运输。
注意事项
1. 为了您的健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。本产品仅作科研用途。
2. 若长期不用，建议将本品置于-20℃保存。请避免离心，干燥和反复冻融。
3. 本产品的储存缓冲液为PBS（含20％乙醇）。
实验流程
1. 收集细胞：每个免疫沉淀反应大约使用106 ~ 107个表达HA-tag 融合蛋白的细胞，可根据HA-tag融合蛋白表达量适当调整细胞数。吸出培养基，向培养皿中加入预冷的1×PBS，漂洗2次，利用细胞刮或胰酶消化收集贴壁细胞，细胞转移到离心管，500 g离心3 min并丢弃上清液。
2. 细胞裂解：
1）在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，用1.0 mL预冷的裂解缓冲液重悬细胞。对于膜蛋白或核/染色质蛋白，可使用RIPA裂解液，或普通IP裂解液结合超声破碎细胞的方法。
2）置于冰上30分钟，可每10分钟充分吹打一次，或者在4度旋转混合仪上裂解。
3）4℃，20,000g 离心15分钟，将裂解产物（上清）转移到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。
注意：此时细胞裂解产物可长期保存于-80℃。
3. 平衡磁珠（选做）：充分混匀HA Nanobody Magnetic Beads，吸取20 μL该产品到500 μL预冷的裂解缓冲液中，在磁力架上分离磁珠直到上清变成清亮的状态，丢弃上清液（建议吸取20 μL珠子悬液时剪掉枪头的前端）。
4. 结合蛋白：
1）将细胞裂解产物加入到平衡的HA Nanobody Magnetic Beads中（如果未做第3步，可在细胞裂解产物中直接加入20 μL该产品），在4℃冷柜中的旋转混合仪上结合30 ~ 120 min。如果需要，保存50 μL的裂解产物作为input进行免疫印迹分析。
2）在磁力架上分离磁珠直到上清变成清亮的状态，丢弃上清液。
5. 清洗磁珠：用1.0 mL预冷的裂解缓冲液中重悬上一步骤中的HA Nanobody Magnetic Beads，在4℃旋转混合洗涤5 min，在磁力架上分离磁珠直到上清变成清亮的状态，丢弃上清液并重复清洗2次。
6. 洗脱蛋白（根据下游用途选择洗脱方法）：
1）SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法：加入20 ~ 50 μL 2×SDS-sample buffer重悬HA Nanobody Magnetic Beads。95℃，加热10 min充分变性，把免疫沉淀复合物从珠子上游离出来，然后在4℃，2,500 g离心3 min收集上清，收集的产物可进行SDS-PAGE及免疫印迹分析。
2）酸性洗脱法：加入50 μL 0.2 M pH2.5的甘氨酸洗脱结合的蛋白，孵育时间30 s，期间不断混匀，离心后收集上清至新的离心管中，立即加入5 μL 1.0 M Tris（pH10.4）以中和酸性的甘氨酸。
注意：为了提高洗脱效率可以重复这一步。
3）HA融合蛋白洗脱法：加入过量的HA-peptide进行洗脱。
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