- 产品参数
- 产品货号： DW008
- 产品规格： 20 T / 100 T
- 品牌： belongbio
产品信息
产品概述
线粒体膜电位降低是细胞早期凋亡的一个标志，它发生在细胞膜上的磷酯酰丝氨酸外翻与caspase水解酶激活之前。当线粒体膜通透性发生改变时，膜电位会降低。这种膜电位的改变是由于Bax二聚体的形成和Bid, Bak, Bad的激活，从而诱导线粒体膜形成孔 隙造成的。当这些促凋亡蛋白被激活时，线粒体同时也将细胞色素C释放到细胞质中。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位△ Ψm的理想荧光探针，它可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。JC-1单体的最大激发波长为510 nm，最大发射波长为527 nm；JC-1聚合物的最大激发波长为585 nm，最大发射波长为590 nm。这款试剂盒操作简单快速，可以通过流式细胞仪，荧光显微镜或荧光酶标仪检测。
储存条件
≤0℃运输，-20℃避光保存。有效期三年。
注意事项
1. 为了您的健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作，本产品仅作科研用途。
2. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
3. B组份也可以放4℃保存；为避免反复冻融，A与C组分建议分装。
实验方法
（一）试剂准备
1. 配制 JC-1 工作液
按如下方案配置1mL 1×JC-1染色工作液:取10uL 100×JC-1染色液，加入到890 μL灭菌的diH20中，涡旋混匀，向上述混合液中加入100 μL 10×Assay Buffer，涡旋混匀，即可得到1×JC-1染色液。
注：①配置体积可同比例扩大或缩小；②不建议直接用1×Assay Buffer稀释100×JC-1染色液，可能会出现沉淀。
2. 配制1×Assay Buffer
用diH20按10：1稀释检测缓冲液（如1 mL 10×Assay Buffer + 9 mL diH20）。
（二）流式细胞染色方案
开始实验之前，请确保JC-1和CCCP溶液已恢复至室温。
1. 按实验所需，在培养板中接种细胞（悬浮细胞不要超过106个/mL）。
2. 阳性对照组：根据培养基的量加入相应体积50 mM的CCCP溶液（如终浓度为50 μM即1 mL培养基加入1 μL 50 mM的CCCP溶液），37℃孵育20 min。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。
3. 对于贴壁细胞，染色前先进行消化处理，将其制成细胞悬液，0.5 mL装于离心管中。
4. 室温下400×g，离心5 min，去上清。
5. 用0.5 mL的JC-1工作液重悬细胞，置于37℃细胞培养箱，孵育15 min。
6. 室温下400×g，离心5 min，去上清。
7. 用2 mL的PBS缓冲液、培养基或1×Assay Buffer重悬细胞，离心去除上清，重复一次。
8. 用0.5mL的PBS、培养基或1×Assay Buffer重悬细胞，用流式细胞仪检测分析。
9. 对于正常细胞，在PE或PI（FL2）通道可以检测到线粒体内的JC-1红色聚集物；对于凋亡细胞，在FITC（FL1）通道可以检测到JC-1绿色单体物。
（三）流式细胞染色方案
1. 悬浮细胞染色
（1）参照流式细胞仪染色方案，对细胞进行染色。
（2）用0.3 mL的PBS或培养基重悬细胞。
2. 贴壁细胞染色
（1）在培养皿或培养板上接种细胞。
（2）阳性对照组:根据培养基的量加入相应体积50 mM的CCCP溶液（如终浓度为50 μM即1 mL培养基加入1 μL 50 mM的CCCP溶液），37℃孵育20 min。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。
（3）去除培养基，加入JC-1工作液使其覆盖细胞表面。
（4）置于37℃细胞培养箱，孵育15 min。
（5）除去染液，用PBS缓冲液、培养基或1× Assay Buffer清洗一次细胞。
（6）用荧光显微镜观察分析。
3. 荧光显微镜观察
采用可以同时检测荧光素和罗丹明，或者荧光素与 Texas Red 的双通道滤波器荧光显微镜观察细胞。
（1）对干正常细胞，拥有完整的线粒体膜电位，线粒体在590 nm处发出红色荧光，细胞质发出绿色荧光；
（2）对于凋亡或坏死的细胞，染料以单体形式存在，在530 nm处发出绿色荧光。
4. 测定荧光相对比率染色方案
（1）按照实验要求在 96 孔板中接种细胞。
（2）阳性对照组：根据培养基的量加入相应体积50 mM的CCCP溶液（如终浓度为500 μM即1 mL培养基加入1 μL 50 mM的CCCP溶液），37℃孵育20 min。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。
（3）根据荧光显微镜细胞染色方案对细胞进行染色处理。
（4）用荧光酶标仪检测荧光值（红色荧光；Ex/Em=550/600 nm；绿色荧光Ex/Em=485/535 nm）。
（5）计算红绿荧光比值。与正常细胞相比，在凋亡或坏死细胞中，红绿荧光比值会降低。
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