- 产品参数
- 产品货号： DW011
- 产品规格： 20 T/50 T
- 品牌： belongbio
产品信息
产品概述
细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体DNA的降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度 的DNA片段约为180 bp ~ 200 bp的整数倍，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状Ladder图谱，本试剂盒采用TUNEL法， 应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡细胞断裂DNA的3´-OH末端催化掺入555- dUTP。555-dUTP标记的DNA可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。TUNE法可以选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的DNA链断裂的细胞。TUNEL实验中，TdT酶催化dUTP掺入断裂的DNA链的3´-OH末端。抗原标记的dUTP（如 digoxin-dUTP、生物素-dUTP），因为它可以直接进行原位检测，是一种更快速、直接的检测手段。
储存条件
-20℃避光保存，≤0℃运输。有效期两年。
【注】：组分A需避光保存，避免反复冻融。
注意事项
1. 本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
2. 使用前将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。
3. 染色背景较重或非特异性着色明显时可适当减少染色时间。
4. 实验时建议增加阴性对照和阳性对照组。
5. 组分A使用时请佩戴口罩、手套，如接触皮肤，请立即用大量水冲洗。
6. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
产品参数
使用方法
(一）实验设计
1. 阳性对照：DNase I处理制备阳性对照载玻片。DNase I可以消化单链或双链DNA暴露3'- OH末端，人为造成细胞凋亡。每次实验做一次即可（用来验证本次实验操作和试剂盒有无问题）。
2. 阴性对照：使用不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH₂O替代TdT Enzyme（主要是排除细胞自身凋亡、操作过程等原因导致的非特异性染色以及调整拍摄曝光强度）。
3. 实验处理组：实验组按照说明书正常操作。
4. 实验对照组：实验组按照说明书正常操作。
(二）实验步骤
1. 样本准备：
（1）对于贴壁细胞或细胞涂片
a. PBS清洗1次。
【注】：如果担心细胞涂片的细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。
b. 固定：加入适量4％多聚甲醛（PBS配制），4℃固定30 min。PBS清洗2次。
c. 通透：加入适量0.4% Triton Ⅹ-100（PBS配制），室温通透20 min。PBS清洗2次。
d. 转步骤 2. TUNEL反应。
（2）对于最浮细胞或细胞悬液
a. 收集细胞（3 ~ 5×106 个细胞），1000 rpm离心5 min ，PBS清洗2次。
b. 固定：加入适量4％多聚甲醛（PBS配制）充分重悬细胞，4℃固定30 min。2000 rpm离心5 min，PBS清洗2次。
c. 通透：加入适量0.4% Triton Ⅹ-100（PBS配制），室温通透20 min。2000 rpm离心5min，PBS清洗2次。
d . 转步骤 2. TUNEL反应。
（3）石蜡组织切片
a. 将石蜡切片置于切片架上，放置于60℃烘箱中烤片60 min。
b. 脱蜡与水化：将切片样本依次放入二甲苯I（10 min）→ 甲苯II（10min）→ 100％乙醇I（5 min）→ 100％乙醇II（5 min）→ 95％乙醇（5 min）→ 90％乙醇（5 min）→ 80％乙醇（5 min）→ 70％乙醇（5 min）→ ddH₂O冲洗5 min，冲洗2次。
【注】：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。
c. 用滤纸吸干切片样本周围液体，用免疫组化笔圈好样本轮廓，以便下游通透与标记。
【注】：若在后续实验操作中发现免疫组化笔画的轮廓圈被破坏，需及时补画。
d. 通透：按1：50的比例，将2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀释至终浓度40 µg/mL ，在每个样本上滴加100 µL，使溶液覆盖全部样本区域，37℃孵育30 min。
【注】：Proteinase K可通透细胞膜和核膜，从而使后续步骤的染色试剂充分进入细胞核进行反应，提高标记效率。孵育时间会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载玻片上脱落的风险，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。为得到更好的结果，Protainase K的浓度、孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化。
e. 将切片样本浸入1×PBS漂洗三次，每次5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样本放在湿盒中保持湿润。
【注】：这一步必须把Proteinase K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
f. 转步骤 2. TUNEL反应。
（4）冰冻组织切片
a. 固定：取出冰冻切片，并回温至室温。将切片样本浸入4％多聚甲醇（PBS配制）中，室温固定30 min。将切片样本浸入1×PBS漂洗三次，每次10 min。
【注】：若是担心甲醛清洗不干净，影响最终染色效果。可在甲醛固定完成后加入适量2 mg/mL甘氨酸清洗10 min，中和残留的固定液，再进行PBS清洗。
b. 用滤纸吸干切片样本周围液体，用免疫组化笔圈好样本轮廓，以便下游通透与标记。
【注】：若在后续实验操作中发现免疫组化笔画的轮廓圈被破坏，需及时补画。
c. 通透：按1:50的比例，将2 mg / mL的Protelnase K溶液用PBS稀释至浓度40 µg / mL，在每个样本上滴加100 µL，使溶 液覆盖全部样本区域，37℃孵育30 min。
【注】：Protenasa K可通透细胞和核膜，从而使后续步骤的染色试剂充分进入细胞核进行反应，提高标记效率。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载波片上脱落的风险，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。为得到更好的结果，Proteinase K的浓度、孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化。如优化Proteinase K的浓度与孵育时间仍无法改善染色效果，可选择将样本浸入1% Titon×-100（PBS配制）中，室温促渗3 ~ 5 min；之后将切片样本浸入1×PBS漂洗三次，每次5 min。
d. 将切片样本浸入1×PBS漂洗三次，每次5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样本放在湿盒中保持湿润。
【注】：这一步必须把Proteinase K洗涤干净，否则会严重干扰后读的标记反应。
e . 转步骤 2 .TUNEL反应。
（5）阳性处理（仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行TUNEL反应步骤）
a. 按1：10的比例用ddH₂O将10×DNase I Buffer稀释成1×DNase I Buffer备用。
b. 滴加100 µL 1×DNase I Buffer到已处理的样本上，覆盖全那样本区域，室温平衡5 min。
c. 用1×DNase I Buffer以1：100稀释DNase I（2 U/µL）至终浓度20 U/mL的工作液。
d. 弃去Buffer，加入100 µL浓度为20 U/mL的DNase I工作液，室温孵育15 min。
e. 弃去DNase I工作液，PBS清洗2次。
f. 转步骤 2 .TUNEL反应。
2. TUNEL反应
（1）配制TUNEL反应液（即用即配）：
（2）对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片
a. 每个样品加入50 µL TUNEL反应液，使反应液均匀覆盖样本。37℃避光孵育适宜的时间（细胞推荐染色时间15、30 min ~ 1 h）。
【注】：加入50 µL TUNEL反应液适合涂片、切片或96孔板（其他不同孔板可以适当调整TUNEL反应液体积，覆盖细胞即可）。如果待检测的样品为涂片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸发膜，或自行尝试使用自封袋或者其它适当材料自行裁剪成比孔略小的圆形塑料片，滴加TUNEL反应液后覆盖在样品上，可以防止TUNEL反应液蒸发，并且使TUNEL反应液均匀覆盖样本。
b. 弃去TUNEL反应液，PBS清洗2次后，再用1% Titon Ⅹ-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）清洗3次，每次5 min，这样游离的未反应的标记物可以清除较干净。
c.（可选）每个样本加入适量浓度为5 µg/mL的DAPI染液，室温避光孵育5 min。染色完成后，弃去DAPI染液，PBS清洗2次，每次5 min。
d.（可选）切片封片：每个样本滴加20 µL抗荧光淬灭封片剂（FZ006），抗荧光淬灭封片剂可能会不适用于某些染料。（实验前建议进行预实验测试匹配性），盖上盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。
e. 用滤纸吸去多余的液体，向样本区域加100 µL PBS保持样本湿润，立即在荧光显微镜下观察。
（3）对于悬浮细胞或细胞悬液
a. 每个样本管加入50 µL TUNEL反应液轻轻重悬细胞，37℃避光孵育15 ~ 30 min。每隔10 min用微量移液器轻轻重悬细胞。
b. 2000 rpm离心5 min，弃去TUNEL反应液，加入适量0.1% Titon Ⅹ-100（PBS配制，其中含5 mg /mL BSA）清洗2次，每次5 min，这样游离的未反应的标记物可以清除较干净。
c. 每个样本管加入100 µL浓度为5 µg /mL的DAPI染液，室温避光孵育5 min。
d. 加入400 µL PBS重悬细胞，立即用流式细胞仪检测或进行涂片后在荧光显微镜下观察。
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