- 产品参数
- 产品货号： TSA011
- 产品规格： 100 rxns
- 品牌： belongbio
产品信息
产品概述
酪酰胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification）技术是一类利用辣根过氧化物酶（HRP）对靶蛋白进行标记的酶学检测方法。类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术采用多聚HRP标记的二抗，HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品稳定的共价结合酪胺荧光素，结果使其检测信号得到10 ~ 100倍增强。之后用热修复法洗去非共价结合的“一抗-二抗-HRP”复合物，重复下一种 “一抗-HRP-二抗”来第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。 由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗、二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。本产品适用于石蜡组织切片、 冰冻组织切片、细胞爬片等的免疫荧光染色。
储存条件
TYR-XXX荧光染料（即用型）、TSA+增强剂置于-30 ~ -15℃；其余组分置于4℃保存。≤0℃运输， 有效期一年。
注意事项
1. TSA+增强剂在低温下为固体状态，使用前需解冻。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
实验流程
1. 样品准备
1）石蜡切片：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 15 min-二甲苯Ⅱ 15min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min -95%乙醇5min-85%乙醇5min - 75%乙醇5min，蒸馏水洗。
2）冷冻切片：冰冻切片固定10 ~ 30 min，PBS洗5 min，重复3次，滴加0.3% Triton-X100破膜液通透20 min，PBS洗5 min，重复3次。
3）细胞爬片或细胞涂片：细胞样本固定10 ~ 30 min，PBS洗5 min，重复3次，滴加0.3% TritonX-100破膜液通透20 min，PBS洗5 min，重复3次。
2. 抗原修复：组织切片置于盛满pH9.0 EDTA碱性抗原修复液或者pH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中，于微波炉内进行抗原修复，中火8 min，停火8 min，转中低火7 min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片（也可以用高压1 ~ 2 min；100℃水煮15 min；100℃水浴20 min等其他热修复方法）。自然冷却后将玻片置于PBS（pH7.4）中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
注：修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定，冰冻切片和细胞样本需要使用抗体洗脱液来进行抗体洗脱。
3. 阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育15 min。将玻片置于PBS（pH 7.4）中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。
4. 非特异性靶点封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加封闭用正常山羊血清（或者其他封闭液，如3% BSA溶液）均匀覆盖组织，室温封闭30 min。
注：抗体稀释液中含有各种保护剂以及防腐剂，可以用来封闭或者稀释一抗，稀释后的一抗可以长期4℃保存 （在常温下也可以保存一个月）。
5. 孵育一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗X，切片平放于避光湿盒内，4℃孵育过夜或者37℃孵育1~2 h（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。
6. 孵育多聚HRP二抗：玻片置于PBS（pH7.4）中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的多聚HRP二抗覆盖组织，避光室温孵育50 min，PBS洗三次。
7. TSA荧光染料反应液反应：直接滴加50 μL即用型TYR-XXX荧光染料，TSA荧光染料反应液均匀覆盖组织室温反应3 ~ 15 min（最佳时间5 min ~ 10 min），PBS洗三次。
注：TSA+增强剂能够进一步增强荧光信号（放大5 ~ 10倍），可根据实际的荧光显色强度选择是否添加。使用比例为TSA+增强剂：TYR-XXX荧光染料=1：500。
8. 抗体洗脱：切片置于抗原修复液中100℃水浴25 ~ 40 min（根据不同抗体亲和力灵活调整时间）或者滴加适量37℃预热至完全溶解的mIHC专用抗体洗脱液（冰冻切片/爬片/骨组织建议用）覆盖样本，37℃放置5 ~ 20 min，弃去洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本37℃放置5 ~ 20 min， 弃去洗脱液，PBS洗三次，每次5 min（石蜡切片可用热修复洗脱或者抗体洗脱液洗脱，细胞及冰切切片需用抗体洗脱液进行洗脱）。
9. 重复3 ~ 8步骤（换用另一种TYR-XXX荧光染，进行第二轮标记）。
10. 重复3 ~ 8步骤（换用另一种TYR-XXX荧光染，进行第三轮标记）。
11. 重复3 ~ 8步骤（换用另一种TYR-XXX荧光染，进行第四轮标记）。
12. 重复3 ~ 8步骤（换用另一种TYR-XXX荧光染，进行第五轮标记）
13. 重复3 ~ 7步骤（换用另一种TYR-XXX荧光染，进行第六轮标记）。
14. DAPI复染细胞核：玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI即用型染液，避光室温孵育5 min ~ 20 min。
15. 封片：玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
16. 镜检拍照：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。
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