- 产品参数
- 产品货号： SC002
- 产品规格： 20 rxns / 50 rxns
- 品牌： belongbio
产品信息
注：Control中包含了4.6 kb的线性化载体和1 kb的插入片段，Amp抗性。使用时直接取10 µL Control加入10 µL 2×One-Step Cloning kit，即组成20 µL重组反应体系。
产品描述
本产品为基于同源重组原理开发的DNA无缝克隆试剂盒。该试剂盒具有独特的非连接酶依赖性体系，可将外源DNA片段定向克隆至任意载体的任意位点。增强型重组酶与优化的反应缓冲液显著提高了克隆的重组效率与对杂质的耐受度，从而实现简单、快速、高效的重组克隆。插入片段和线性化载体在重组酶作用下，仅需37℃反应5 ~ 30min即可完成重组，重组产物不依赖连接酶，即可直接转化至感受态细胞，所获得的阳性克隆率在95%以上。适用范围：基因克隆、定点突变、DNA拼接等。
储存条件
-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。
实验原理与流程
1. 载体线性化：酶切或反向PCR制备线性化载体；
2. 插入片段的制备：由PCR制备，所用扩增引物在设计时需在其5’端添加同源序列（图中以红色和蓝色标记），使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化载体之间各有一段同源序列。
3. 重组反应：按比例混合线性化载体和插入片段，在重组酶催化作用下，37℃反应15 min即可完成重组。
4. 转化：将重组产物转化感受态细胞，平板上会形成数百个单克隆供后期阳性筛选。
图.同源重组示意图
使用方法
（一）线性化载体制备
1. 选择合适的克隆位点：尽量选择无重复序列且载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量在40% ~ 60%之间的位点。
2. 载体线性化：常使用限制性内切酶消化，或反向PCR扩增的方法制备。
1）酶切法：推荐使用双酶切方法使载体线性化完全，降低转化背景（假阳性克隆）；若使用单酶切线性化，请适当延长酶切时间以减少环状质粒残留，降低转化背景。
2）反向PCR扩增法：PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。
（二）插入片段获得
引物设计原则：同源臂（15-20 bp，GC含量40% ~ 60%）+酶切位点（根据实验需求保留或者删除）+特异性引物。可参照以下实例：
A. 克隆载体选用单酶切线性化（BamH I）：
B. 克隆载体选用双酶切线性化（Hind III+EcoR I）：
C. 克隆载体选用反向PCR扩增制备：
注：若最终引物长度超过40 bp，推荐在引物合成时选用PAGE纯化。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，引入的同源序列及酶切位点不应参与计算。
（三）重组反应
1. 浓度测定
推荐使用琼脂糖凝胶电泳比较条带亮度的方法对DNA进行定量。将线性化载体和插入片段扩增产物做数个等体积稀释梯度，原始产物和稀释后产物各取1 μL进行琼脂糖凝胶电泳，与DNA分子量标准（DNA Marker）比较条带亮度以确定其近似浓度。若线性化载体与插入片段扩增产物进行了纯化处理，且经电泳检测无明显杂带或拖尾现象时，可使用Nanodrop等仪器通过吸光值进行浓度测定。
2. 线性化载体与插入片段使用量重组反应体系最适克隆载体用量为0.03 pmol，最适插入片段用量为0.06 pmol（载体和外源插入片段的最佳摩尔比为1：2）。
推荐通过片段长度计算粗略用量：
最适克隆载体使用量（ng）=[0.02×克隆载体碱基对数]ng
最适克隆载体使用量（ng）=[0.04×插入片段碱基对数]ng
注：低于2 kb的载体取最低使用量40 ng，低于0.5 kb的外源插入片段取最低使用量20 ng。
3. 重组反应体系（推荐冰上配制）
4. 重组反应条件
37℃反应15 min。反应结束后，将反应产物置于冰上5 min以终止反应。
注：推荐使用PCR仪等温控较精准的仪器反应，反应温度或反应时长相差过大会影响克隆效率。反应产物可直接用于转化实验，或存于-20℃存放。
（四）转化
1. 冰上解冻克隆用感受态细胞（如：DH5α Competent cell等）。
2. 取上一步重组反应液10 µL加入到100 µL感受态细胞中（重组产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/10），轻柔混匀后于冰上静置30 min。
3. 42℃热激90 sec后，立即转移至冰上静置2 min。
4. 加入900 µL无抗的SOC或LB液体培养基（不添加抗生素），37℃摇菌1 h（转速180 ~ 200 rpm）。
5. 5,000 rpm离心3 min，弃掉900 μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含正确抗性的平板上轻轻涂匀。
6. 平板于 37℃培养箱中倒置培养过夜。
（五）重组产物鉴定
1）菌落PCR鉴定：使用无菌枪头或牙签挑取单克隆至PCR体系中扩增。推荐至少用一条载体上的引物进行菌落PCR，以避免假阳性的结果。
2）酶切鉴定：使用无菌枪头或牙签挑取单克隆至含相应抗生素的LB培养基中过夜培养，提取质粒后使用相应内切酶进行酶切，通过电泳检测片段大小。
3）测序鉴定：使用载体上的合适引物进行测序分析及鉴定。
六、常见问题及解决方案
（一）平板上未长出克隆或克隆数目很少
1. 引物设计不正确：引物设计原则一般为同源臂（15 ~ 20 bp，GC含量40% ~ 60%）+酶切位点（根据实验需求保留或者删除）+特异性引物。
2. 线性化载体和外源插入片段的使用比例不佳：请参考说明书中推荐的使用量和使用比例。
3. 线性化载体和外源插入片段不纯，抑制反应：未经纯化的DNA片段，使用体积不应超过反应体系总体积的1/5；可对线性化载体、外源插入片段进行纯化后使用。
4. 感受态细胞效率低：使用新鲜制备或妥善保存的克隆用感受态细胞。
（二）多数克隆不含插入片段或含有不正确的插入片段
1. 非特异性扩增：优化PCR条件体系，提高产物特异性；挑取更多克隆进行鉴定。
2. 克隆载体线性化不完全：通过阴性对照检测载体是否线性化完全，优化酶切体系，提高内切酶使用量、延长酶切时间等。
3. 反应体系污染：体系中混入具有相同抗性的环状质粒。
（三）菌落 PCR 无条带
1. 引物不正确：推荐使用载体的通用引物或至少使用一条通用引物进行菌落PCR检测。
2. PCR 体系或程序不合适：优化PCR体系和反应程序；提取质粒，将质粒作为模板进行PCR验证；使用酶切方法鉴定。
3. 重组失败：载体线性化不完全，可能出现空载，建议优化酶切体系。
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