- 产品参数
- 产品货号： ZH005
- 产品规格： 20 T/100 T
- 品牌： belongbio
产品信息
产品概述
细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。EdU（5-Ethynyl-2`- deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，其连有的炔烃基团在天然化合物中很少见，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）掺入正在复制的 DNA分子中，通过基于EdU与荧光染料的特异性共轭反应，把荧光基团标记到新合成的含有EdU的DNA上面，这样可以进行高效快速的检测出 DNA复制活性， 此技术广泛应用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA损伤修复等方面的研究。传统的免疫荧光染色（BrdU）检测方法需要DNA变性、抗原修复、抗原抗体过夜孵育等复杂繁琐的操作步骤。而EdU检测方法不需要剧烈的DNA变性，只需温和的细胞固定化和透化处理，能够较好地保护细胞形态、DNA整体结构及细胞内抗原识别位点，操作步骤更加快速、灵敏和准确。EdU 与胸腺嘧啶（T）结构非常相似，大小却只有BrdU抗体的1/500，很容易在细胞内扩散；无需抗原抗体反应，能在细胞和组织水平更快速便捷地反映DNA复制活性。本试剂适用于小鼠、大鼠及其它动物模型的各种组织器官的细胞增殖情况检测。
储存条件
常温运输。4℃保存，有效期一年。
使用方法
本试剂盒适用于各种动物活体注射，稳定性较好，对活体无副作用。注射标记后可将目标组织制备为石蜡或冰冻切片进行EdU染色检测。
【注】：切片后可搭配EdU细胞增殖成像分析试剂盒使用，进行后续的切片EdU染色检测。
（一）动物实验方法，以1 cm×1 cm切片为例
实验前须知：EdU的分子量为252.223，易溶于水，PBS，生理盐水等溶液，便于动物注射使用。建议EdU的初始给药量为5 mg/kg，稀释浓度为0.5 ~ 1 mg/mL。具体动物模型的注射量可根据相关文献进行调节。
【注】：我们根据每只小鼠20 g的体重为例，10 mg EdU粉末可以注射100只小鼠（100 T）。
（二）动物 EdU 注射
【注】：①注射方式：依据实验决定，如：腹腔注射、皮下注射、肌肉注射、尾静脉注射等方式。
②标记时间：最佳标记时间依据具体实验目的而定，增殖快速的组织及器官采用短时间标记（<12 h ）(例如小肠），增殖速度慢的组织及器官可采用长时间标记（如7 d或更长时间，例如大脑）。
③标记浓度：最佳标记浓度依据具体实验而定。
④取样部位：根据实验目的而定，一次标记可对多种组织和器官进行组织切片。因小肠上皮组织增殖速度较快，标记时间较短（动物注射6 d后取组织），建议预实验可以取小肠组织检测细胞增殖情况，作为阳性对照。
（三）切片处理
(1) 切片前处理：组织器官先进行清洗，以去除血液、组织或器官中残留的 EdU，降低背景。
(2) 切片厚度：3 ~ 10 um为宜，切片过厚可能影响切片背景。
(3) 切片后处理：①石蜡切片脱蜡：二甲苯洗脱3次，每次10 min，乙醇梯度（100%，95%，85%，75%）脱水各1次，去离子水洗脱1次。②冰冻切片处理：室温放置30 min后，4℃丙酮固定10 min，PBS清洗3次，每次5 min。
(4) 2 mg/mL甘氨酸清洗切片10 min。
(5) 加入100 µL 0.5% Triton×-100细胞通透剂，室温孵育10 min，再用PBS清洗1次。
（四）EdU染色
(1) 通过用10：1去离子水稀释反应缓冲液，进行配制 1×反应缓冲液。
(2) 按照溶解200 mg缓冲添加剂溶于1 mL去离子水的比列称取适量的粉末进行溶解，即为可用的缓冲添加剂的浓度，建议现用现配。
【注】：缓冲添加剂为白色粉末，较难准确称量，称量范围可稍微放宽，但是不应超过±20%，且该粉末较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需报废或更换。
(3) 按照以下的表格进行染色反应液的配制：
(4) 加入以上配置好的检测混合液，体积以覆盖细胞为宜，充分重悬细胞，避光、室温孵育10 ~ 30 min。
(5) 弃染色反应液，加入300 µL 0.5% Triton×-100 细胞渗透液清洗2 ~ 3次，每次10 min；
(6) 弃细胞渗透液，用PBS洗两次，每次5 min。
（五）DNA 染色
1. 将Hoechst 33342*超级纯*用PBS 溶液1：1000进行稀释得到1×Hoechst染色液。
2. 加入150 µL1×Hoechst 染色液，室温避光孵育10 ~ 15 min后，弃染色液。
3. PBS清洗细胞2 ~ 3次，去掉洗液。
（六）其它染色（自备）
（可选）可以根据实验需要进行细胞表面或细胞内抗原的抗体染色。
（七）流式检测及分析
建议染色完成后立即进行荧光显微镜拍照观察；如果条件限制，请于4℃条件下避光湿润保存3 d之内完成拍照。可使用抗荧光淬灭封片剂进行封片后于4℃条件下保存及拍照检测。
注意事项
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
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