First Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)（RM002）
- 产品货号： RM002
- 产品规格： 20 rxns / 100 rxns / 500 rxns
- 品牌： belongbio
- 产品参数
- 产品货号： RM002
- 产品规格： 20 rxns / 100 rxns / 500 rxns
- 品牌： belongbio
产品信息
产品概述
First Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）包含新一代逆转录酶Reverse Transcriptase和针对逆转录优化的最适Buffer，进一步提高了一链合成的效率。该试剂盒中的5×gDNA wiper Mix可在42℃，2 min条件下快速去除基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠，并可简化qPCR引物设计，无需跨内含子设计引物。试剂盒中包含单组分逆转录引物Oligo（dT）18VN和Random Primers，用户可根据需要，灵活选择逆转录引物进行后续实验。本试剂盒既可合成用于克隆等下游实验的全长cDNA，亦可合成高度均一的用于qPCR定量的cDNA，适用于动物、植物以及微生物RNA的逆转录反应。
储存条件
-30 ~ -15℃避光保存，≤0℃运输，有效期12个月。
注意事项
1. 实验时请佩戴一次性手套及口罩，规范操作。
2. 本品为由RNA制备cDNA的反转录试剂，在提取RNA和反转录过程中要严防RNase污染。建议佩戴好手套和口罩，使用无RNase污染的实验耗材等。
3. 若后续实验为PCR：如果模板为真核生物来源，一般情况下首选Oligo（dT）18VN，与真核生物mRNA的3' Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。基因特异性引物(GSP)的特异性最高，但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成，这时可改用Oligo（dT）18VN或Random Primers重新进行逆转录。Random Primers特异性最低，所有RNA，包括mRNA，rRNA，tRNA均可以作为Random Primers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，使用Oligo（dT）18VN或基因特异性引物（GSP）无法有效引导cDNA合成时，可使用Random Primers为引物。
4. 若后续实验为qPCR：将Oligo(dT)18VN与Random Primers以指导比例混合使用，可使mRNA的各个区域cDNA合成效率相同，有助于提高定量结果的真实性重复性。可以不经过基因组去除步骤直接进行逆转录，空余体积以Nuclease-free Water补足即可。
实验流程
后续实验为PCR：
1. RNA模板变性
在在RNase-free离心管中配制如下混合液：
65℃加热5 min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2 min。
注：
（1） RNA模板变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。对于长度超过3 kb的cDNA片段，请勿省略此变性步骤。
（2）Total RNA or Poly A+RNA建议1 µg。
2. 基因组DNA去除
用移液器轻轻吹打混匀。42℃，2 min。
3. 配制第一链cDNA合成反应液：
注：该产品亦适用于基因特异性引物（GSP）引发的逆转录，为避免gDNA wiper对GSP的潜在影响，请在该步骤体系中加入基因特异性引物（2 pmol）。
4. 第一链cDNA合成反应条件：
注：
*1：仅当使用Random Primers时需要此步骤；使用Oligo（dT）18VN或GSP时省略此步骤。
*2：如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可将反应温度提高至60℃，有助于提高产量。
5. 产物可立即用于PCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-70℃保存。 cDNA应避免反复冻融。
后续实验为qPCR：
1. 基因组DNA去除
用移液器轻轻吹打混匀。42℃，2 min。
2. 配制第一链cDNA合成反应液：
注：该产品亦适用于基因特异性引物（GSP）引发的逆转录，为避免gDNA wiper对GSP的潜在影响，请在该步骤体系中加入基因特异性引物（2 pmol）。
3. 第一链cDNA合成反应条件：
*1：如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可将反应温度提高至60℃，有助于提高产量。
4. 产物可立即用于qPCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-70℃保存。cDNA应避免反复冻融。
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