- 产品参数
- 产品货号： TR003
- 产品规格： 50 rxns / 250 rxns
- 品牌： belongbio
产品信息
注：①每瓶Buffer VHB在使用前需添加 17 mL（TR003-01）/140 mL（TR003-02）无水乙醇；
②每瓶Buffer RW2在使用前需添加 80 mL（TR003-01）/200 mL（TR003-02）无水乙醇。
产品概述
本试剂盒适合于从无细胞体液或培养液等样品中纯化病毒RNA。本试剂盒不使用酚氯仿等有毒试剂，基于硅胶柱纯化技术，能快速高效结合地从1 ~ 560 μL无细胞液样品如血清、血浆、无细胞体液或培养液中提取病毒RNA，整个提取过程仅需25 min，获得的RNA可直接用于RT-PCR、Northern杂交、以及各种病毒检测等。本产品已经成功地提取了乙肝A/C、丙肝RNA、SARS以及 HIV 等。
储存条件
常温保存。常温运输，有效期18个月。Carrier RNA长期保存建议置于-20℃。
注意事项
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 部分溶液在低温下可能有沉淀生成，55℃水浴即可使沉淀完全溶解。
3. Carrier RNA干粉，使用前加入适量的Nuclease-free Water至1 µg/µL，涡旋溶解，保存-20℃。
实验流程
实验前配制Buffer VRL/Carrier RNA 混合液：每1 mL Buffer VRL, 加入4 µL Carrier RNA（1 µg/µL）。Buffer VRL/Carrier RNA 混合液可在2 ~ 8℃稳定放置1个月。低温放置时，混合液可能会有沉淀析出，使用前，于60℃水浴3 min让沉淀完全溶解。
（一）病毒总 RNA 抽提（离心方案）
该方案适合于从140 µL的血清，血浆，尿液，无细胞培养液以及各种无细胞体液中抽提病毒RNA（该方案也能提取得到病毒 DNA，但是效率较低）。
1. 向1.5 mL离心管中加入560 μL Buffer VRL（含 Carrier RNA）。
2. 将140 µL血清，血浆，尿液，无细胞培养液或体液至装有 Buffer VRL（含 Carrier RNA）的离心管中，立即涡旋混匀10 s，室温静置10 min。该步骤的样品可置于-20℃长期保存。样品静置后仍浑浊，14,000xg 离心5 min去除不溶解杂质，以免出现堵柱情况。
3. 向上一步的裂解液中加入560 μL无水乙醇，涡旋混匀10 s（若样品体积超过140 µL，则按比例调整无水乙醇的体积）。
4. 将700 μL混合液转移至Viral Micro Column（过滤柱放入收集管中），10,000xg 离心30 ~ 60 s。
5. 弃去滤液后，将柱子装回收集管中，将剩余滤液转移至柱中，10,000xg离心30 ~ 60 s，弃去滤液。重复此步骤直至所有混合液过滤完毕。
6. 弃去滤液后，将柱子装回收集管中，加入500 μL Buffer VHB（请确保按照要求加入无水乙醇），10,000xg离心30 ~ 60 s。
7. 弃去滤液后，将柱子装回收集管中，加入500 μL Buffer RW2（请确保按照要求加入无水乙醇），10,000xg离心30 ~ 60 s。
8. 重复步骤7。
9. 弃去滤液后，将柱子装回收集管中，13,000xg离心空柱3 min。
10. 将柱子转移至洁净的1.5 mL EP管中，向柱子的膜中央悬空滴加30 ~ 100 μL Nuclease-free Water。室温静置2 min，13,000xg离心1 min。
11. 弃去柱子，提取的RNA可直接用于下游实验，或置于-80℃保存。
（二）病毒总 RNA 抽提（负压抽滤）
该方案采用负压抽滤方案，适合于从140 µL的血清，血浆，尿液，无细胞培养液以及各种无细胞体液中抽提病毒RNA（该方案也能提取得到病毒DNA，但是效率较低)。进行该方案操作时，必须准备真空泵和真空抽滤盒。
1. 按照方案（一）的步骤1 ~ 3操作，得到混合液。
2. 连接好真空泵和真空抽滤盒，把柱子插到真空抽滤盒的接口处。
3. 将获得的混合液转移至主子中，打开真空泵进行抽滤。持续转移混合液至柱子中，直到所有混合液都过滤完毕。
4. 当溶液抽滤完毕后，加入500 μL Buffer VHB（请确保按照要求加入无水乙醇）至柱中。
5. 当溶液抽滤完毕后，加入500 μL Buffer RW2（请确保按照要求加入无水乙醇）至柱中。
6. 当溶液抽滤完毕后，加入500 μL Buffer RW2（请确保按照要求加入无水乙醇）至柱中。
7. 取下柱子，套入收集管中，13,000xg离心空柱3 min。
8. 将柱子转移至洁净的1.5 mL EP管中，向柱子的膜中央悬空滴加30 ~ 100 μL Nuclease-free Water。室温静置2 min，13,000xg离心1 min。
9. 弃去柱子，提取的RNA可直接用于下游实验，或置于-80℃保存。
（三）大体积样品的病毒总 RNA 抽提
该方案采适合于从大体积500 µL的血清，血浆，尿液，无细胞培养液以及各种无细胞体液中抽提病毒RNA。
1. 将500 µL拭子浸泡液、匀浆液上清液、血清等无细胞上清液等待测样品加入到5 ml离心管中。
2. 加入1000 µL Buffer VRL（含 Carrier RNA），立即涡旋混匀10 s，室温静置 10 min。
3. 加入500 µL异丙醇至样品中，颠倒混匀6 ~ 8次。
4. 按照方案（一）或（二）的步骤进行操作。处理某些样品时，柱子可能会出现堵塞现象。出现这种情况时，可提高离心速度于15,000xg和延长离心时间至3 min，以确保混合液全部过滤完毕。
（四）病毒的浓缩
血清、血浆、尿液和其它体液常常只含很低的病毒滴度，处理这种情况时，推荐浓缩不超过3.5 mL的样品至终体积为140 µL，然后再按方案（一）或方案（二）进行操作。
1. 采用小量病毒浓缩柱，转移＜3.5 mL样品至浓缩柱。按病毒浓缩柱的说明书，离心将样品浓缩至140 µL。
2. 按照方案（一）或（二）的步骤进行操作。
（五）病毒DNA的抽提
由于本试剂盒无法区别DNA和RNA，我们建议使用无细胞的体液或培养液，以减少纯化产物中DNA和宿主RNA的干扰。骨髓，尿液，唾液和口腔拭子都含有较多的细胞，可用1500xg离心10 min沉淀去除细胞，取上清液再进行操作。DNA病毒比较难裂解，需Proteinase K才能充分裂解。纯化产物中的DNA污染，可采用DNase I消化的方法来去除。若需要处理含细胞的样品，如全血、带细胞的体液、拭子等，也可以采用方案（一）进行操作。由于血液或含细胞的体液有丰富的蛋白质，样品用量不能超过140 µL，否则会引起柱子的堵塞。
（六）病毒的浓缩
该方案适合于从粪便样品，动物组织，拭子等固体样品中提取病毒RNA，需自配一瓶PBS或细胞裂解液。
粪便样品
1. 取0.3g粪便样品，加入1 mL PBS，高速涡旋3 min。
2. 14,000xg离心 3 min。
3. 转移140 μL上清，按照方案（一）或（二）的步骤进行操作。
动物组织
1. 取0.3g组织样品，加入1 mL PBS，用玻璃匀浆器进行匀浆。
2. 14,000xg离心3 min。
3. 转移140 μL上清，按照方案（一）或（二）的步骤进行操作。
口腔拭子
1. 取1个口腔拭子至1.5 mL离心管中。
2. 加入200 μL 裂解液，涡旋重悬细胞。14,000×g离心3 min。
3. 14,000xg离心1 min，去除细胞核。
4. 转移140 μL上清，按照方案（一）或（二）的步骤进行操作。
血液样品（病毒位于红细胞内）
1. 取140 μL全血样品至1.5 mL离心管中。
2. 加入560 μL Buffer VRL，立即涡旋混匀20 s，室温静置10 min。
3. 按照方案（一）或（二）的步骤进行操作。
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