- 产品参数
- 产品货号： PU009
- 产品规格： 50 rxns / 200 rxns
- 品牌： belongbio
产品信息
注：Buffer WS在使用前需添加60 mL（PU009-01）/120 mL（PU009-02）无水乙醇。
产品描述
本试剂盒采用碱裂解法和硅基质离子交换柱，适于从1 ~ 5 mL细菌培养液中提取质粒DNA。本试剂盒中的纯化柱可以结合的质粒上限约为15 μg，抽提得到的质粒可直接用于各种常规实验，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等。
储存条件
单独的RNase A或者加入RNase A的Solution I请于2 ~ 8℃存放，其余组分可室温保存，有效期12个月。
自备试剂
小型高速离心机，乙醇。
注意事项
1. 第一次使用前把试剂盒提供的RNase A全部加到Solution I中，混匀，并在瓶上做好标记。加入RNase A后4℃存放；
2. 若Solution Ⅱ和Solution Ⅲ出现浑浊现象，可在37℃加热溶解，溶液转为澄清后即可使用，请在使用后及时盖紧盖子；
3. 洗脱体积不应少于30 μL，体积过小会影响洗脱效率；
4. 为保证您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩进行操作。
使用方法
注意：第一次使用前，请在RNase A全部加入到Solution I中，并在瓶上做好标记，于2 ~ 8℃保存。
1. 取1 ~ 5 mL菌液，12000 rpm离心1 min，尽量吸除上清（菌液较多时可以多次离心将菌体收集到同一个离心管中）；
2. 向离心管中加入250 μL Solution I，用移液枪吹打或涡旋仪将菌体重悬（重悬液应混合均匀，无明显团块或絮状物）；
3. 加250 μL Solution Ⅱ，来回颠倒4 ~ 6次轻柔混匀，得到澄清的裂解液，静置2 ~ 3 min（请避免剧烈混匀，且裂解时间不要超过5 min）；
4. 加350 μL Solution Ⅲ，颠倒混匀几次直至出现白色絮状沉淀，室温放置2 ~ 3min让其充分反应，室温下12000 rpm离心10 min；
5. 吸取上一步骤离心后的上清至质粒纯化柱中（纯化柱套入收集管中），12000 rpm离心1 min，倒弃收集管内液体，将吸附柱重新放回收集管中；
6. 向纯化柱中加入700 μL Buffer WS，12000 rpm离心1 min，倒弃收集管内液体，将吸附柱重新放回收集管中；
7. 重复步骤6一次；
8. 12000 rpm离心2 min，将纯化柱敞口于室温下放置2 min，使纯化柱中残留液体完全挥发；
9. 将纯化柱转移至新的洁净EP中，向吸附膜中央悬空滴加50 ~ 100 μL Elution Buffer（亦可用Nuclease-free Water替代），静置1 min，12000 rpm离心1 min。若想增加质粒的回收效率，可重复一次洗脱步骤；
10. 弃去纯化柱，所得质粒可直接用于后续实验，或于-20℃保存。
常见问题
（一）质粒得率低
1. 质粒拷贝数低：增加菌量，或更换具有相同功能的高拷贝数载体；
2. 菌株老化：涂布平板培养后，重新挑选单菌落进行液体培养；
3. 菌体中无质粒：细菌培养时间过长，细菌大量死亡，会导致质粒丢失；可能有些质粒在某些菌种中无法稳定存在，多次转接后可能丢失；请检查筛选用的抗生素浓度是否正确；
4. 菌体裂解不充分：尝试减少菌量或增加Solution I，Ⅱ，Ⅲ用量；
5. 洗脱不充分：洗脱液pH不适宜会导致洗脱效率低，请确保洗脱液的pH>7.5。建议对洗脱液适当加温或延长孵育时间。
（二）质粒纯度不高
1. 混有RNA：RNase A消化不彻底，尝试减少菌量或加入Solution Ⅲ后延长放置时间。若Solution I放置时间较久，请重新加入RNase A；
2. 混有基因组DNA：若加入Solution Ⅱ后剧烈震荡，可能会使基因组DNA断裂并混杂在质粒中；
3. 乙醇残留：洗涤后上清未吸净或磁珠未完全干燥，导致洗脱液污染；
4. 质粒的二聚体和多聚体形式：质粒复制过程中形成，与宿主菌相关，电泳可检测。
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