- 产品参数
- 产品货号： PU004
- 产品规格： 50 rxns / 200 rxns
- 品牌： belongbio
产品信息
注：Wash WS在使用前需添加60 mL（PU004-01）/120 mL（PU004-02）无水乙醇。
产品描述
本试剂盒使用磁珠法从菌体中提取质粒DNA。通过碱裂解法及离心处理将细胞碎片和SDS复合物沉淀下来，在优化的缓冲体系中，磁珠可以特异吸附上清中的质粒DNA，其他杂质如蛋白质、盐离子等则被除去，最终获得高质量的质粒DNA。纯化的质粒可直接用于测序、酶切、PCR和转化等后续实验。
产品特点
1. 操作安全简捷，提取的质粒DNA质量高。
2. 磁珠性能稳定，可重复性好。
储存条件
单独的RNase A或者加入RNase A的Solution I请于2 ~ 8℃存放，其余组分可室温保存，有效期12个月。
自备试剂
小型高速离心机，乙醇，磁力架（推荐MagiCute磁力架MC001）。
注意事项
1. 磁珠使用前必须混匀，否则会影响样品的回收率；
2. 若Solution Ⅱ出现浑浊现象，可在37℃加热几分钟，溶液转为澄清后即可使用，请在使用后及时盖紧盖子；
3. 磁珠性能稳定，可重复性好。
使用方法
注意：第一次使用前，请将RNase A全部加入到Solution I中，并在瓶上做好标记，于2 ~ 8℃保存；Bind MagBeads在使用前请务必振荡混匀。
1. 取1 ~ 5 mL菌液，12000 rpm离心1 min，尽量吸除上清（菌液较多时可以多次离心将菌体收集到同一个离心管中）；
2. 向离心管中加入250 μL Solution I，用移液枪吹打或涡旋仪将菌体重悬；
3. 加250 μL Solution Ⅱ，来回颠倒4 ~ 6次轻柔混匀，得到澄清的裂解液，静置2 ~ 3 min（请避免剧烈混匀，且裂解时间不要超过5 min）；
4. 加350 μL Solution Ⅲ，颠倒混匀几次直至出现白色絮状沉淀，室温放置2 ~ 3min让其充分反应；
5. 室温下12000 rpm离心10 min；
6. 吸取上一步骤离心后的上清至新的EP管中，加入0.7倍体积Bind MagBeads，吹打混匀后于室温孵育8 min；
7. 将样品置于磁力架上磁吸5 min，待磁珠完全聚集后，小心移除上清液（离心管仍置于磁力架上）；
8. 保持样品置于磁力架上，使用700 μL Wash Buffer漂洗磁珠，室温孵育30 s，小心吸去上清；
9. 重复上一步操作，共漂洗两次，尽量吸净残留液体；
10. 保持样品置于磁力架上，室温下开盖干燥磁珠3 ~ 5 min，使残留的乙醇等液体完全挥发（磁珠表面无明显光泽即可）；
11. 将样品从磁力架取出，加入60 ~ 100 µL Elution Buffer（亦可用Nuclease-free Water替代），用移液枪轻轻吹打混匀，室温孵育3 min；
12. 将样品置于磁力架上，待磁珠完全聚集后（约2 min左右），小心吸取上清至新的管Nuclease-free离心管中。获得的质粒可直接进入下一步试验，或者-20℃储存。
常见问题
（一）质粒得率低
1. 质粒拷贝数低：增加菌量，或更换具有相同功能的高拷贝数载体；
2. 菌株老化：涂布平板培养后，重新挑选单菌落进行液体培养；
3. 菌体中无质粒：细菌培养时间过长，细菌大量死亡，会导致质粒丢失；可能有些质粒在某些菌种中无法稳定存在，多次转接后可能丢失；请检查筛选用的抗生素浓度是否正确；
4. 菌体裂解不充分：尝试减少菌量或增加Solution I，Ⅱ，Ⅲ用量；
5. 洗脱不充分：洗脱液pH不适宜会导致洗脱效率低，请确保洗脱液的pH>7.5。建议对洗脱液适当加温或延长孵育时间。
（二）质粒纯度不高
1. 混有RNA：RNase A消化不彻底，尝试减少菌量或加入Solution Ⅲ后延长放置时间。若Solution I放置时间较久，请重新加入RNase A；
2. 混有基因组DNA：若加入Solution Ⅱ后剧烈震荡，可能会使基因组DNA断裂并混杂在质粒中；
3. 乙醇残留：洗涤后上清未吸净或磁珠未完全干燥，导致洗脱液污染；
4. 质粒的二聚体和多聚体形式：质粒复制过程中形成，与宿主菌相关，电泳可检测。
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